Die Städtischen Museen und ihre Sammlungen gehen zurück auf bürgerschaftliches Engagement: 1879 erfolgte die Gründung des Historischen Museums. Träger war der Historische Verein Heilbronn, dessen Interesse hauptsächlich der Erforschung von Vor- und Frühgeschichte in Stadt und Region galt.

Bereits seit den 1860er Jahren veranstaltete der Verein für Vaterländische Naturkunde in Württemberg Ausstellungen in Heilbronn. Gemeinsam mit dem Naturwissenschaftlichen Museumsverein Heilbronn ebnete er den Weg für die Einrichtung des Robert-Mayer-Museums für Naturkunde, das 1914 seine Pforten öffnete.  

Archäologischen Funden der Region widmete sich das 1935 gegründete das Alfred-Schliz-Museum. Benannt war es nach dem Heilbronner Stadtarzt und Altertumsforscher Alfred Schliz, der als Vorsitzender des Historischen Vereins ab 1899 auch den Heilbronner Museen vorgestanden und deren Sammlungsbestand erheblich vergrößert hatte.

Im Zweiten Weltkrieg wurden alle drei Museen sowie 90 Prozent der Städtischen Sammlungen bei einem Bombenangriff auf die Heilbronner Innenstadt am 4. Dezember 1944 zerstört. Die aus den Trümmern geborgene Überreste bildeten die Grundlage für Konzeption und Aufbau der neuen Städtischen Museen ab den 1950er Jahren. Unter dem ersten hauptamtlichen Museumsdirektor Andreas Pfeiffer wurde ab 1977 die museale Präsentation um Kunst- und Kulturgegenstände der Gegenwart erweitert. Seit 1991 sind die städtischen Sammlungen im Museum im Deutschhof zu sehen.